2024年5月24日， Plant Communications期刊在线发表了北京大学现代农业研究院刘晓芹实验室题目为“Single-nucleus RNA and ATAC sequencing analyses provide molecular insights into early pod development of peanut fruit”的研究论文。

 地下结果（geocarpy）是特定植物适应生态环境的生殖策略。花生又名“落花生”作为一种重要的豆科油料和经济作物，是一种典型的地上开花地下结果植物。花生开花后一旦受精，果针就会向下弯曲响应重力并不断伸长将子房推入土壤，进而荚果在地下逐渐发育。花生荚果的形成方式独特，其产量和品质高度依赖于子房柄的向重力生长和荚果在土壤中的膨大发育。

花生地上果针到地下荚果的发育涉及到复杂土壤环境的变化，因此需要多个基因在不同组织中的协调调控，为探索花生荚果发育的分子机制，我们分别对空中果针（Aerpeg）、入土果针（Subpeg）和膨大荚果（Exppod）的细胞解剖特征进行了表征，并整合了单细胞核RNA测序（snRNA-seq）和单细胞核ATAC测序（snATAC-seq）数据，对花生果针入土及荚果发育进行了单细胞基因表达和染色质可及性的分析挖掘，同时结合原位RNA杂交验证和伪时间系列分析，揭示了调控果针重力反应和果针入土到荚果膨大的关键基因调控网络，提供了对花生荚果发育的深入见解。 

图1. 花生荚果三个发育阶段的解剖特征

为了深入探究花生果针发育早期阶段的显微结构及细胞类型的多样性，我们首次对花生三个关键时期的荚果进行了细致的切片分析。在这一过程中，我们成功鉴定了荚果早期发育过程中的主要细胞类型，包括机械组织、分生组织、种皮以及胚乳等（图1）。随后，借助先进的snRNA-seq和snATAC-seq数据分析技术，我们对获得的49,896个细胞进行了精确的聚类，最终划分为21个独特的细胞群。我们通过标记基因对这些细胞群进行鉴定，分别鉴定出一系列新基因比如HMGB6、KIN10A和ARM重复超家族蛋白基因在分生组织中具有特异性表达、DMT1和RECQL1则在胚细胞中显著高表达、CESA基因在木质部细胞中特异表达、CYP87A3在表皮细胞中表现出高表达特性，这些发现揭示了这些基因在各自细胞类型中的独特且关键的功能，我们进一步通过原位杂交技术验证成功鉴定到的9个主要的细胞类型（图2）。这为花生果针发育早期的细胞类型及其基因表达提供了丰富的数据支持。

图2. 花生早期荚果的细胞类型注释和细胞周期分析

果针入土前后，需要适应土壤机械压力以及光暗环境的变化，我们通过伪时间分析发现cuticular layer和periderm细胞在这一过程中的动态变化，并确定了重要的关键基因KCS，通过瞬时过表达实验，发现KCS在膜上表达并且其过表达导致叶片失水率降低，花生果针对地下环境的响应，证实了表皮细胞在花生适应环境变化中的重要作用。向地性是花生果针入土的必要条件，研究发现向重力生长相关基因和生长素相关基因，如NPY5、PIN3、SGR6、ABCB15等在果针的维管束细胞中特异表达。此外，PHOT1（蓝光受体）在果针中的表达也表明光在荚果发育中的重要作用，并且生长素、向地性和光相关基因在荚果发育过程中都呈现下调趋势。

荚果的膨大始于壳内薄壁细胞的发育，为后期种子生长创造空间。通过比较各cluster在发育过程中的比例变化以及marker gene标记。我们发现，在荚果发育过程中，cluster 0是数量增加迅速的薄壁细胞，拟时间分析显示top200的拟时间差异基因中，生长素相关基因AUX28、IAA9、YAB5和ARF被鉴定出来，并显示出随着拟时间的进展而上调的模式。两个YAB5基因和三个MADS-box转录因子（两个AGL5和一个AGL1）在cluster 0中特异性表达，并在荚果发育过程中上调，IAA9在豆荚发育过程中也上调，有趣的是，IAA9也是我们之前大量转录组数据中发现的影响豆荚发育的关键基因（Cui et al.，2022）。上述基因的qPCR结果也证实了这种表达模式，揭示了这些基因在豆荚发育过程中的上调；原位RNA杂交显示在豆荚膨胀过程中，靠近种子的壳内壁薄壁细胞组织中存在明显的AGL5信号。我们随后通过亚细胞定位、基因表达模式鉴定、蛋白相互作用等实验发现AGL5、YAB5、IAA可能是通过形成一个共同发挥作用的复合体调控薄壁细胞的发育，进一步正向调控花生荚果的不断膨大（图3）。同时我们也通过ATAC数据分析将膨大的荚果与未膨大的果针进行比较，发现其存在的24个不同的基序均被归类为乙烯响应的ERF相关基序，表明它们在地下荚果的发育膨大中至关重要，这一发现支持了之前的假设，即地下荚果膨大受乙烯调控，而乙烯的产生是由土壤机械压力引发的。  

图3. 花生果壳内薄壁细胞发育调控基因

综上，本研究首次将花生荚果这一个特殊组织的不同细胞类型进行精细分类，并对它们早期的发育轨迹详细研究。首次鉴定了包含胚，分生组织，表皮细胞，维管细胞等多种细胞类型特异表达基因，为后续基因功能研究提供了丰富的数据基础。通过整合snRNA-seq和snATAC-seq数据，我们发现不同细胞类型的染色质可及性和基因表达模式之间的相关性，揭示了果针向重力反应、荚果膨大和环境适应过程中关键基因的动态变化和调控机制。这些发现不仅揭示了对花生荚果发育机制的深入见解，也为提高花生产量和品质提供了重要的理论依据和参考。

                           图4. 光相关基因的表达以及荚果早期发育基因表达调控模式图

本研究由北京大学现代农业研究院花生功能基因组学与种质资源创新实验室完成，北京大学现代农业研究院助理研究员崔媛媛和北京大学在读博士研究生苏晏宁为论文共同第一作者，实验室主任刘晓芹研究员为通讯作者，邓兴旺院士对该论文提供了一定的指导。本研究获得山东省泰山学者、山东省自然科学基金等项目的资助。

全文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2590346224002876